Editado por Peter Sarnow, Stanford University School of Medicine, Stanford University, California, aprobado o 25 de decembro de 2020 (revisado o 25 de outubro de 2020)
Informamos da interacción entre subunidades na replicación dos complexos de coronavirus-transcrición, que son esenciais para a replicación e a conservación evolutiva.Proporcionamos probas de que o dominio NiRAN asociado con nsp12 ten actividade de nucleósido monofosfato (NMP) transferase en trans, e identificamos nsp9 (unha proteína de unión ao ARN) como o seu obxectivo.NiRAN cataliza a unión covalente do resto de NMP ao extremo amino nsp9 conservado nunha reacción que depende dos ións Mn2+ e dos residuos de Asn conservados adxacentes.Descubriuse que a actividade de NiRAN e a NMPilación de nsp9 son esenciais para a replicación do coronavirus.Os datos permítennos vincular esta actividade do marcador encimático do virus aniñado coas observacións anteriores na hipótese de que o inicio da síntese de ARN nunha clase de virus de ARN é consistente funcional e evolutivamente.
A ARN polimerase dependente do ARN (RdRps) de Nidovirales (Coronaviridae, Arterioviridae e outras 12 familias) está ligada ao dominio amino-terminal (N-terminal) na proteína non estrutural (nsp) liberada da poliproteína, chamada NiRAN. 1ab está composto por protease principal viral (Mpro).Anteriormente, informouse da actividade de GMPilación/UMPilación do propio virus arterial NiRAN-RdRp nsp, e suxeriuse que xerara un transitorio para a transferencia de monofosfato de nucleósidos (NMP) ao virus (actualmente descoñecido) e/ou cousas de biopolimerización celular.Aquí, mostramos que o coronavirus (coronavirus humano [HCoV]-229E e síndrome respiratorio agudo grave Coronavirus 2) nsp12 (NiRAN-RdRp) ten actividade de NMPilación dependente de Mn2+, que se deriva de nsp9 mediante a formación de nsp9 mediada por Mpro. a nsps flanqueante N-terminal é liberada proteolíticamente, o fosforamidato únese á amina primaria (N3825) no N-terminal de nsp9.O trifosfato de uridina é o nucleótido preferido nesta reacción, pero o trifosfato de adenosina, o trifosfato de guanosina e o trifosfato de citidina tamén son co-substratos adecuados.Estudos de mutacións utilizando proteínas recombinantes do coronavirus nsp9 e nsp12 e mutantes HCoV-229E modificados xeneticamente determinaron os residuos necesarios para a NMPilación de nsp9 mediada por NiRAN e a replicación do virus no cultivo celular.Os datos confirmaron a predición dos residuos do sitio activo de NiRAN e determinaron o importante papel dos residuos de nsp9 N3826 na NMPilación de nsp9 e na replicación do virus in vitro.Este residuo forma parte da secuencia do tripéptido NNE N-terminal conservado e demostrou ser o único residuo invariante de nsp9 e os seus homólogos na familia do coronavirus.Este estudo proporciona unha base sólida para o estudo funcional da actividade de NMPilación doutros virus aniñados e propón posibles obxectivos para o desenvolvemento de fármacos antivirais.
O virus de ARN de cadea positiva Nidovirales infecta unha variedade de vertebrados e invertebrados (1, 2).A orde inclúe actualmente 14 familias (3), das cales a familia do Coronavirus foi estudada amplamente nos últimos 20 anos.Nese momento, tres coronavirus zoonóticos xurdiron de animais hóspedes e causaron brotes a gran escala de infeccións respiratorias graves en humanos.Incluídas as pandemias persistentes causadas por enfermidades infecciosas agudas graves.Síndrome Respiratorio Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) (4âââ7).Os nidovirus comparten unha organización xenómica común, e a subunidade do complexo de replicación e transcrición ligado a membrana (RTC) está codificada nos dous terzos 5-?²-terminais e na subunidade estrutural principal da partícula do virus, así como nalgúns accesorios. .Proteína, codificada no terzo final 3??² do xenoma (1).Salvo unha familia de virus planarios (Monoviridae) (8), todos os virus aniñados codifican subunidades RTC en dous grandes marcos de lectura abertos (ORF) ORF1a e ORF1b, que se traducen a partir do ARN xenómico de.ORF1a codifica a poliproteína (pp) 1a, e ORF1a e ORF1b codifican conxuntamente pp1ab.Coa participación xeral da protease principal (Mpro) codificada por ORF1a, tanto pp1a como pp1ab son procesados proteolíticamente nunha variedade de proteínas non estruturais (nsps), tamén coñecidas como 3CLpro, porque ten homoloxía co 3Cpro do picornavirus. 9).Crese que estes nsps se ensamblan nun gran RTC dinámico, catalizan a síntese de ARN xenómico (replicación) e un conxunto de ARN subxenómico (transcrición), e úsanse para coordinar a expresión do ORF situado augas abaixo de ORF1b (10 ? ? 12).
O RTC central inclúe a ARN polimerase dependente do ARN (RdRp) (13), a helicase da superfamilia 1 (HEL1) (14, 15) e varios encimas de procesamento de ARN, que están codificados principalmente en ORF1b e na familia do coronavirus. Contén nsp12-nsp16 e nsp9-nsp12 na familia Arterioviridae (ver referencia 10ââ 12).RdRp e HEL1 representan dous (un quinto) dominios conservados do virus do niño de ave e teñen homoloxía entre outros virus de ARN.Crese que a replicase do núcleo está asistida por outras subunidades, incluíndo varias pequenas nsps liberadas da rexión carboxi-terminal (C-terminal) de pp1a, augas abaixo de Mpro (coronavirus nsp5 e virus arterial nsp4, respectivamente).Teñen unha protecciÃ3n especÃfica familiar limitada e actividades diversas (revisado na referencia 10ââ12).
Fai relativamente pouco tempo, atopouse un dominio con características únicas de motivos de secuencia no extremo amino terminal (N-terminal) adxacente a RdRp en todos os virus aniñados, pero ningún outro virus de ARN (16).En base á súa localización e actividade da nucleótido transferase (nucleósido monofosfato [NMP] transferase), este dominio chámase NiRAN (Nestvirus RdRp-related nucleotide transferase).A combinación de dobre dominio de NiRAN-RdRp constitúe nsp12 na familia Coronaviridae e nsp9 na familia Arterioviridae, e noutros nestoviridae espérase que NiRAN-RdRp se libere como un nsp independente da poliproteína viral.No coronavirus, o dominio NiRAN contén residuos ??1/450 e está conectado ao dominio RdRp C-terminal a través da rexión de enlace (16-19).No virus da arterite equina (EAV) (Arteriviridae), a nsp9 recombinante mostra actividades de UMPilación e GMPilación (auto) dependentes do ión Mn2+, que dependen de tres bases de secuencia conservadas no nestovirus, AN, BN e CN Os residuos da secuencia.Onde N significa NiRAN) (16).O flanqueo N-terminal destes motivos é un motivo preAN menos conservador.Algúns destes residuos tamén se conservan en proteína quinases moi relacionadas, onde se demostrou que están implicados na unión de nucleósidos trifosfato (NTP) e na actividade catalítica (20, 21).De acordo con esta observación, pódense reunir varios residuos de sitios activos clave na pseudoquinase SelO de Pseudomonas syringae co supercomplexo SARS-CoV-2 nsp7/8/12/13 publicado recentemente.Residuos conservados de Coronavirus NiRAN superpostos na microestrutura electrónica.Proteína recombinante (17).Especúlase que a (auto) U/GMPilación documentada producirá un estado transitorio para transferir NMP ao substrato (actualmente descoñecido) (16), e a semellanza estrutural entre NiRAN e a proteína quinase (17, 19) é a hipótese de que NiRAN modifica outras proteínas.
Moitas características, incluída a súa asociación sistemática única e única con virus aniñados e a separación xenética de RdRp, fan do NiRAN un encima regulador clave razoable para os virus aniñados, que é fundamental para a súa aparición e identidade.Anteriormente, chamáronse tres funcións posibles que implican NiRAN para regular a tradución do xenoma/subxenómico ou a replicación/transcrición.Ao considerar os datos escasos e incompletos dispoñibles no momento, cada función ten as súas vantaxes e inconvenientes (16).Nesta investigación, pretendemos combinar os estudos bioquímicos e xenéticos inversos dos coronavirus que representan os dous xéneros e poñer os nosos descubrimentos no fondo evolutivo da mutación natural da familia dos coronavirus, para coñecer este misterioso reino.Informamos de importantes avances na comprensión de NiRAN a través da identificación de dianas naturais en RTC, o que (entre as tres hipóteses dispoñibles) contribúe ao papel deste dominio no inicio da síntese de ARN do virus aniñado.Esta investigación tamén abre posibilidades para outras funcións de NiRAN na interface do servidor do virus.
Para caracterizar as propiedades enzimáticas do dominio NiRAN relacionado co virus corona nsp12, producimos unha forma recombinante do coronavirus humano 229E (HCoV-229E) nsp12 en E. coli, cunha etiqueta His6 no extremo C-terminal, e combinamos o proteína con [α32-P ] Incubar xunto con NTP en presenza de MnCl2 como se describe en Materiais e métodos.A análise do produto da reacción indicou a presenza dunha proteína radiomarcada que comigra con nsp12 (106 kDa), o que indica que o coronavirus nsp12 cataliza a formación de aductos covalentes de proteína-NMP, formados preferentemente con monofosfato de uridina (UMP) (Figura 1A) e B).A análise cuantitativa mostrou que, en comparación con outros nucleótidos, a intensidade do sinal de incorporación de UMP aumentou de 2 a 3 veces (Figura 1C).Estes datos son consistentes coa actividade predita da NMP transferase do dominio NiRAN do coronavirus (16), pero indican que as preferencias de nucleótidos do dominio NiRAN do coronavirus e do virus arterial son diferentes.
Actividade de auto-NMPilación do HCoV-229E nsp12.(A) Incubouse o HCoV-229E nsp12-His6 (106 kDa) co NTP designado [α-32P] en presenza de MnCl2 6 mM durante 30 minutos (consulte Materiais e métodos para máis detalles).Os produtos de reacción separáronse mediante SDS-PAGE e tinguironse con azul brillante de Coomassie.(B) A proteína radiomarcada visualízase mediante imaxes de fósforo.As posicións de nsp12-His6 e os marcadores de masa molecular das proteínas (en quilodaltóns) móstranse en A e B. (C) A intensidade do sinal radioactivo (media ± SEM) determinouse a partir de tres experimentos independentes.*P≤0,05.A intensidade do sinal (porcentaxe) está relacionada coa UTP.
Aínda que se demostrou que as actividades enzimáticas relacionadas co NiRAN son esenciais para a replicación de EAV e SARS-CoV en cultivos celulares (16), aínda non se determinaron a función específica de NiRAN e as dianas potenciais.A semellanza estrutural recentemente informada entre o NiRAN e unha familia de proteínas con pregamentos parecidos a proteína quinase (17, 22) levounos a probar a hipótese de que o NiRAN cataliza a NMPilación doutras proteínas.Xeramos un conxunto de dianas homólogas potenciais, incluíndo proteínas non estruturais codificadas por HCoV-229E ORF1a (nsps 5, 7, 8, 9, 10), cada unha contén unha etiqueta His6 C-terminal (apéndice SI, táboa S1) e incubar estas proteínas con [α32-P]uridina trifosfato ([α32-P]UTP) en presenza ou ausencia de nsp12.A albúmina sérica bovina e a proteína de fusión MBP-LacZα producidas en E. coli serviron como controis (Figura 2A, pistas 1 a 7).A proteína radiomarcada analizouse mediante electroforese en xel de dodecilsulfato de sodio-poliacrilamida (SDS-PAGE) e autorradiografía, e descubriuse que había un forte sinal radioactivo na reacción que contén nsp12 e nsp9.A posición do sinal corresponde á masa molecular de nsp9, o que indica a UMPilación de nsp9 mediada por nsp12 (Figura 2B, pista 7).Non se atopou ningunha outra proteína de proba UMPilated, o que nos levou a concluír que nsp9 é un substrato específico de nsp12.De acordo cos datos de auto-NMPilación mostrados na Figura 1, nsp12 é capaz de transferir os catro NMP a nsp9, aínda que a eficiencia é diferente, UMP> monofosfato de adenosina (AMP)> monofosfato de guanosina (GMP)> monofosfato de citidina (CMP)) Imaxe).3 A e B).Nas condicións utilizadas neste ensaio (acurtar o tempo de reacción e exposición, reducir a concentración de nsp12; materiais e métodos), non se puido detectar a auto-NMPilación de nsp12 (compare a figura 2B, a pista 7 e a figura 1B), que demostrou ser un UMP efectivo (E varias roldas) pasou de nsp12 a nsp9.A actividade da UMP transferase require a presenza de ións Mn2+, como se mostra na Figura 3C, mentres que só se observou unha actividade mínima da UMP transferase en presenza de Mg2+, e ningunha actividade en presenza dos outros dous catións divalentes probados.Obtivéronse datos similares en ensaios de NMPilación que conteñen citidina trifosfato (CTP), guanosina trifosfato (GTP) e adenosina trifosfato (ATP) (apéndice SI, Figura S1).
HCoV-229E UMPilación de nsp9 mediada por nsp12.Utilizáronse unha serie de substratos proteicos (incluíndo a albúmina sérica bovina, MBP-lacZα e unha serie de nsps HCoV-229E marcados con His6 C-terminal codificado por ORF1a) para avaliar a actividade de UMPilación de HCoV-229E nsp12-His6⁺ mediada. proteína.Incubar a proteína con [α-32P] UTP durante 10 minutos en ausencia (A) ou presenza (B) de nsp12 como se describe nos materiais e métodos.Na parte superior de A e B móstrase un xel de SDS-poliacrilamida tinguido con Coomassie Brilliant Blue, e na parte inferior de A e B móstranse os autorradiogramas correspondentes.A posición do marcador de masa molecular da proteína (en quilodaltons) dáse á esquerda.Tamén se indica a posición de nsp12-His6 (B, arriba) e o sinal radioactivo observado durante a incubación de nsp12-His6 con nsp9-His6 (B, pista 7), o que indica que [α-32P]UMP a nsp9-His6 (12,9 kDa), que non se observou para outras proteínas probadas.
HCoV-229E Caracterización bioquímica e virolóxica mediada por NiRAN da NMPilación de nsp9.(A e B) O papel do cosubstrato de nucleótidos utilizado na reacción.Nsp12-His6 e nsp9-His6 mestúranse e incúbanse en presenza de diferentes [α-32P] NTP no ensaio estándar de NMPilación.(A, arriba) nsp9-His6 tinguido de Coomassie separado por SDS-PAGE.(A, inferior) Autorradiografía da mesma área do xel.(B) A actividade relativa (media ± SEM) en presenza do cofactor de nucleótidos designado determínase a partir de tres experimentos independentes.*P≤0,05.(C) O papel dos ións metálicos.Móstrase a proba de NMPilación estándar en presenza de [α-32P] UTP e diferentes ións metálicos, cada un cunha concentración de 1 mM.En C, a parte superior móstrase con nsp9-His6 tinguido de Coomassie, e en C, a parte inferior, móstrase a autorradiografía correspondente.O tamaño da proteína marcada (en quilodaltons) móstrase á esquerda de A e C. (D) A forma mutante de HCoV-229E nsp12-His6 que leva a substitución de aminoácidos especificada está en [α-32P]UTP, como se describe en Materiais e Métodos.O nsp9-His6 radiomarcado producido na reacción de NMPilación detéctase mediante imaxes de fosforilación (D, arriba).A actividade relativa en comparación coa proteína de tipo salvaxe (en peso) móstrase en D, e a parte inferior tómase como a media (± SEM) de tres experimentos independentes.Os asteriscos indican substitucións de residuos non conservados.(E) O título de virus no sobrenadante de cultivo de células p1 obtido 24 horas despois da infección determinouse mediante ensaio de placas.Indícanse as substitucións de codóns no dominio NiRAN do mutante HCoV-229E manipulado (a numeración dos residuos baséase na súa posición en pp1ab).O mutante do sitio activo RdRp con deficiencia de replicación nsp12_DD4823/4AA utilizouse como control.
Co fin de obter unha comprensión máis profunda do sitio activo de NiRAN e determinar os residuos relacionados coa actividade da NMP transferase específica de nsp9, realizamos unha análise de mutacións, na que substituímos os residuos conservadores nos motivos NiRAN AN, BN e CN. 16) É Ala (apéndice SI, Figura S2).Ademais, avaliouse o impacto das substitucións conservadoras de Arg-to-Lys ou Lys-to-Arg en dous casos.Como control (negativo), os residuos que non están ou menos conservados no dominio NiRAN dos coronavirus e outros virus aniñados son substituídos por Ala. Substituíndo K4116A (no motivo preAN), K4135A (AN), R4178A (BN), D4188A (motivo). BN) e D4280A (CN) reducen ou mesmo eliminan significativamente a NMPilación de nsp9 a través de nsp12, mentres que as proteínas con substitucións conservadoras (R4178K), K4116R) manteñen o 60% e o 80% da súa actividade, o que indica que a relaxación das restricións no seu lado respectivo. as cadeas son fisicoquímicamente sensibles (Figura 3D).A substitución de varios outros residuos conservados E4145A, D4273A, F4281A e D4283A é moito menos prexudicial e a UMPilación de nsp9 só se reduce moderadamente.Obtivéronse resultados similares en reaccións de NMPilación de nsp9 que implican outros NTP (Figura 3D e apéndice SI, Figura S3), confirmando que os efectos observados sobre substitucións específicas de aminoácidos son independentes do tipo de co-substrato de nucleótidos utilizado.A continuación, probamos o posible impacto destas substitucións de nsp12 na replicación de coronavirus en cultivos celulares.Para este fin, utilizamos modelos de ADN complementario (ADNc) modificados xeneticamente apropiados clonados no virus da vacina recombinante (23, 24) para transcribir 5 -7 células.A titulación da proxenie do virus infeccioso producido nestas células mostrou que a maioría dos mutantes NiRAN de HCoV-229E non eran factibles (Figura 3E).Un grupo de mutantes virais non viables inclúe alternativas que se demostraron que eliminan ou reducen significativamente a actividade da NMP transferase in vitro (K4116A, K4135A, R4178A, D4188A, D4280A, D4283A), pero hai outras dúas alternativas (K4116R, E41045A) % reservado?A súa actividade de NMPilación in vitro suxire que están implicadas restricións adicionais.Do mesmo xeito, outras dúas mutacións (R4178K, F4281A) que causaron unha diminución moderada da actividade de NMPilación in vitro de NiRAN produciron virus vivos, porén, estes virus reduciron significativamente os títulos mediante a replicación.En consonancia cos datos de actividade in vitro mostrados na Figura 3D, substituíndo outros catro residuos que non se conservan no coronavirus e/ou noutros virus aniñados (K4113A, D4180A, D4197A, D4273A) (8, 16) produciu virus viables A descendencia, a pesar de ter un título moderadamente reducido en comparación co virus de tipo salvaxe (Figura 3E).
Para estudar se a actividade da NMP transferase mediada por NiRAN depende do dominio RdRp activo, os dous residuos de Asp conservados implicados na coordinación de ións metálicos divalentes (11) no motivo C de RdRp foron substituídos por Ala. A proteína resultante nsp12_DD4823/4AA conserva a súa actividade de NMPilación de nsp9, o que indica que a actividade de NMPilación de nsp9 in vitro mediada por nsp12 non require actividade da polimerase (Apéndice SI, Figura S4).
Despois de establecer a actividade NMP transferase específica de nsp9 para nsp12, tentamos caracterizar o aducto NMP-nsp9 mediante espectrometría de masas (MS).O espectro completo de masas proteicas do HCoV-229E nsp9 recombinante mostrou un pico de 12.045 Da (Figura 4A).A adición de nsp12 non cambiou a calidade de nsp9, o que indica que nsp12 e nsp9 non formarían un complexo estable nas condicións utilizadas (desnaturalización) (Figura 4A).En presenza de UTP e GTP, a medición da masa da reacción que contén nsp9 e nsp12, respectivamente, mostrou que a masa proteica de UTP moveu 306 Da e a masa proteica do GTP moveu 345 Da, o que indica que cada molécula de nsp9 se une a un UMP ou GMP. (Imaxe 4) C e D).Espéculase que a enerxía necesaria para a NMPilación de nsp9 mediada por NiRAN procede da hidrólise de NTP e da liberación de pirofosfato.Aínda que nesta reacción utilizouse un exceso molar de 10 veces de nsp9 (obxectivo) que de nsp12 (enzima), observouse unha NMPilación case completa de nsp9, o que indica que a interacción entre nsp12 e nsp9 é de curta duración e que nsp12 pode NMPilar máis nsp9. molécula in vitro.
NMPilación única de nsp9 en presenza de nsp12 e UTP ou GTP.Móstrase o espectro de masas proteica completa deconvoluted do HCoV-229E nsp9 (apéndice SI, táboa S1) (AD).(A) nsp9 só, (B) nsp9 + nsp12-His6, (C) nsp9 + nsp12-His6 en presenza de UTP, (D) nsp9 + nsp12-His6 en presenza de GTP.
Para determinar os residuos de nsp9 UMPilados por nsp12, nsp9-UMP foi escindida con tripsina.Os péptidos resultantes separáronse mediante nanocromatografía líquida de alto rendemento (HPLC) e analizáronse mediante espectrometría de masas en tándem (MS/MS) en liña.A análise de datos mediante o paquete de software Byonic (Protein Metrics) mostrou a UMPilación do aminoácido N-terminal.Isto confírmase manualmente.O espectro de masas en tándem do péptido precursor [UMP]NNEIMPGK (apéndice SI, Figura S5A) revelou un fragmento a 421 m/z, o que indica que UMP únese ao residuo 1 de nsp9.
No extremo N de nsp9, Asn consérvase entre os membros de Orthocoronavirinae (apéndice SI, figura S6).Aínda que cremos que o nitróxeno da amina primaria do N-terminal é o aceptor máis probable de UMP, decidimos obter probas adicionais da unión de NMP no N-terminal.Por este motivo, o péptido N-terminal non NMPilado e NMPilado nsp9 purificado por HPLC derivouse en presenza de acetona e cianoborohidruro de sodio.Nestas condicións, só as aminas primarias libres poden modificarse con propilo (25).O péptido derivado da nsp9 N-terminal coa secuencia NNEIMPGK contén dúas aminas primarias, unha no extremo N-terminal de Asn e a outra na cadea lateral de Lys no extremo C-terminal.Polo tanto, pódense introducir grupos propilo nos dous extremos.Os cromatogramas iónicos extraídos de péptidos non NMPilados móstranse no apéndice SI, Figura S5B.Como era de esperar, pódense identificar péptidos N-terminais e C-terminais (mono)propilados (apéndice SI, Figura S5B, pista superior) e péptidos dipropilados (apéndice SI, Figura S5B, carril inferior).Este patrón cambia co uso do péptido N-terminal NMPilado de nsp9.Neste caso, só se poden identificar os péptidos propilados C-terminais, pero non se identifican os péptidos propilados N-terminais e os péptidos dipropilados (Apéndice SI, Figura S5C), o que indica que UMP foi transferido á amina primaria N-terminal Para evitar isto. grupo de facer cambios.
A continuación, substituímos (con Ala ou Ser) ou eliminamos os residuos conservados no extremo N-terminal de nsp9 para definir restricións específicas do obxectivo.En base aos nosos datos de MS que mostran que NiRAN forma un aducto nsp9-NMP coa amina primaria do residuo N-terminal de nsp9, plantexamos a hipótese de que a NMPilación de nsp9 require que a protease mestra viral (Mpro, nsp5) libere o N-terminal de nsp9 do o seu precursor poliproteico.Para probar esta hipótese, producimos unha proteína precursora nsp7-11 que contén nsp9 en E. coli e realizamos unha proba de NMPilación estándar en presenza de [α-32P] UTP (materiais e métodos).Como se mostra na Figura 5A (carril 3), o precursor nsp7-11 non cortado non está radiomarcado con nsp12.Pola contra, se nsp7-11 é escindida por nsp5 recombinante para liberar nsp9 (e outras nsps) do precursor, detéctase unha proteína radiomarcada que migra con nsp9, confirmando a nosa conclusión de que NiRAN e a formación N- selectiva de aductos covalentes de nsp9-NMP. .A amina primaria terminal do Asn N-terminal (posición 3825 en pp1a/pp1ab).Esta conclusión tamén está apoiada por experimentos que usan a construción nsp9, que contén un ou dous residuos adicionais no extremo N-terminal.En ambos os casos, eliminouse a UMPylation de nsp9 mediada por NiRAN (apéndice SI, figura S7).A continuación, producimos unha proteína con un ou dous residuos de Asn eliminados da secuencia peptídica 3825-NNEIMPK-3832 no N-terminal de nsp9.En ambos os casos, a UMPilación de nsp9 bloqueouse por completo (Figura 5B), proporcionando evidencia adicional de que o N-terminal real de nsp9 actúa como receptor de NMP.
O procesamento proteolítico de nsp9 e o papel dos residuos N-terminais na UMPilación mediada por nsp12.(A) nsp9 UMPylation require un N-terminal nsp9 libre.Nsp7-11-His6 preincubase a 30 °C nun tampón de detección de NMPilación que contén UTP en presenza ou ausencia de Mpro recombinante (nsp5-His6).Despois de 3 horas, inicie o ensaio de NMPylation engadindo nsp12-His6 como se describe en Materiais e métodos.A reacción que contén nsp5-His6 (carril 1) e nsp9-His6 (carril 2) utilizouse como control.Despois de 10 minutos, a reacción terminou e a mestura de reacción separouse mediante SDS-PAGE.A proteína tinguiuse con Coomassie Brilliant Blue (A, arriba).O precursor de Nsp7-11-His6 e o produto procesado resultante da escisión mediada por nsp5-His6 móstranse á dereita.Teña en conta (debido ao seu pequeno tamaño) que nsp7 e nsp11-His6 non son detectables neste xel, e que a reacción complétase con nsp5-His6 (carrís 1 e 4; a posición de nsp5-His6 indícase cun círculo sólido) ou nsp9-His6 (Carril 2) contén unha pequena cantidade de MBP (indicada por círculos abertos) como impurezas residuais porque se expresan como proteínas de fusión de MBP (apéndice SI, táboa S1).(B) A variante Nsp9-His6 carece dun ou dous residuos de Asn N-terminais (numeración de residuos segundo a posición en pp1a/pp1ab) e é purificada e incubada con nsp12-His6 e [α-32P] UTP.B, SDS-PAGE tinguido con Coomassie móstrase na parte superior, B, a autorradiografía correspondente móstrase na parte inferior.A posición do marcador de peso molecular (en quilodaltons) móstrase á esquerda.(C) Os residuos conservados N-terminais de HCoV-229E nsp9-His6 substituíronse por Ala ou Ser, e utilizouse a mesma cantidade de proteína na reacción de UMPilación mediada por nsp12-His6.Os produtos da reacción separáronse mediante SDS-PAGE e tinguironse con Coomassie Brilliant Blue (C, arriba) e detectouse nsp9-His6 radiomarcado mediante imaxes por fosforescencia (C, medio).Usando proteína de tipo salvaxe (en peso) como referencia (establecido ao 100%), a actividade relativa de NMPilación (media ± SEM) calculouse a partir de tres experimentos independentes.(D) Os títulos de virus no sobrenadante do cultivo de células p1 de células Huh-7 infectadas con células Huh-7 de tipo salvaxe HCoV-229E e mutantes que portan substitucións de aminoácidos designadas en nsp9 determináronse mediante un ensaio de placas.O dobre mutante DD4823/4AA do motivo C RdRp con deficiencia de replicación utilizouse como control negativo.
O extremo N de nsp9 (especialmente as posicións 1, 2, 3 e 6) está moi conservado entre os membros da subfamilia Orthocoronavirinae (apéndice SI, figura S6).Para estudar o posible papel destes residuos na NMPilación de nsp9 mediada por nsp12, substituíronse dous residuos de Asn consecutivos no extremo N-terminal de nsp9 por Ala ou Ser (só ou en combinación).En comparación co nsp9 de tipo salvaxe, a substitución de N3825 por Ala ou Ser resultou nunha redución de máis de dúas veces na UMPilación mediada por nsp12 (Figura 5C).En consonancia coa nosa conclusión de que a NMPilación ocorre na amina primaria N-terminal en lugar da cadea lateral do residuo N-terminal, observamos unha NMPilación residual significativa coa substitución de N3825A e N3825S.Curiosamente, se o segundo Asn é substituído por Ala ou Ser, a UMPilación de nsp9 redúcese con máis forza (máis de 10 veces), mentres que a substitución de Ala nas posicións 3, 4 e 6 só ten un efecto moderado na UMPylation de nsp9 (Figura 2). ).5C).Obtivéronse resultados similares usando ATP, CTP ou GTP (apéndice SI, Figura S8).En conxunto, estes datos indican o papel clave de N2826 (posición 2 en nsp9) na NMPylation de nsp9.
Para obter probas adicionais da correlación funcional entre o N-terminal de nsp9 e a NMPylation, realizamos un aliñamento de secuencias múltiples (MSA) da secuencia nsp9 da familia Coronavirus (variando entre 104 e 113 residuos) (Apéndice SI, Figura). S6).En total, en 47 especies (coñecidas e supostas) de 5 xéneros da subfamilia Orthocoronavirinae que infectan a diferentes mamíferos, aves e hóspedes de réptiles, só se atoparon 8 residuos en total invariantes.Os cambios máis extensos, incluíndo delecións e insercións, observáronse nos ciclos entre os elementos da estrutura secundaria de nsp9, segundo o determinado por estudos estruturais anteriores (26 ??28).Atopáronse cinco residuos invariantes na cadea β e na hélice α da parte C-terminal de nsp9.Tres residuos invariantes constitúen o motivo NNE do extremo N de nsp9.Revélase que o segundo Asn deste motivo é o único residuo invariante, que tamén é compartido polo hipotético nsp9 do coronavirus sapo moi relacionado, e representa a especie Microhyla letovirus 1 da subfamilia Letovirinae de Alphaletovirus.A conservación dos residuos nos elementos da estrutura secundaria nsp9 pódese racionalizar por consideracións estruturais para manter as propiedades de pregamento ou de unión ao ARN coñecidas.Non obstante, este razoamento non parece aplicarse á conservación do NNE, e antes deste estudo, a natureza das restricións que limitan a variación da secuencia do tripéptido estaba completamente escurecida.
Para determinar a importancia da nsp9-NMPylation e a conservación do NNE na replicación do coronavirus, producimos mutantes HCoV-229E, que levan substitucións simples ou dobres de residuos nsp9 N-terminais, o que indica que a nsp9 NMPylation é prexudicial in vitro.Antes de comezar, tentamos responder á pregunta de se estas substitucións (preto do sitio de escisión nsp8|9) afectan ao procesamento proteolítico da rexión pp1a C-terminal.Produciuse un conxunto de construcións de poliproteínas nsp7-11 que conteñen substitucións correspondentes no extremo N de nsp9 en E. coli e cortadas con Mpro recombinante.A escisión proteolítica dos catro sitios (incluíndo o sitio flanqueante de nsp9) non se ve afectada significativamente por ningunha substitución introducida (apéndice SI, figura S9), excluíndo os cambios estruturais nestas proteínas que interfiran coa división de nsp8|9 mediada por Mpro (ou outro) sitio web.
As células Huh-7 transfectáronse con ARN HCoV-229E da lonxitude do xenoma, que codifican substitucións Ala ou Ser nos tripéptidos NNE conservados (N3825, N3826 e E3827) no extremo N nsp9, o que mostra que a maioría das mutacións son mortais.Puidemos rescatar o virus substituíndo o Ser ou Ala do Asn N-terminal (N2835A ou N2835S), pero non logramos recuperar o virus con outras mutacións simples e dobres na secuencia NNE (N3826A, N3826S, NN3825/6AA, NN3825/6SS) , E3827A) (Figura 5D).
Estes resultados indican que a replicación dos coronavirus no cultivo de tecidos está restrinxida (igual ou similar), limitando a mutación natural dos sitios de NMPilación de nsp9 no corpo e apoiando o papel clave desta resposta no ciclo de vida dos coronavirus.
No último conxunto de experimentos, producimos His6 C-terminal marcado con SARS-CoV-2 nsp12 e nsp9, e dúas formas mutantes de nsp12 en E. coli.Os residuos do sitio activo nos dominios NiRAN e RdRp foron, respectivamente, Use Ala (Figura 6A e apéndice SI, táboa S2).K4465 en SARS-CoV-2 nsp12 corresponde a K4135 en HCoV-229E (apéndice SI, Figura S2), que resultou ser necesario para a actividade de NiRAN e a replicación de HCoV-229E (Figura 3D e E).Este residuo tamén corresponde ao residuo do virus arterial EAV nsp9 K94, que previamente se demostrou que era necesario para a auto-UMPilación/auto-GMPilación de NiRAN (16).Como se mostra na Figura 6B, o SARS-CoV-2 nsp12 ten actividade da transferase UMP usando nsp9 como substrato, mentres que o mutante do sitio activo nsp12_K4465A está inactivo.A dobre substitución na secuencia característica SDD do motivo RdRp C non afecta a actividade da transferase UMP (figura 6B), o que indica que a actividade de RdRp non ten ningún efecto directo na UMPilación de nsp9.Os datos similares obtivéronse usando CTP, GTP e ATP (apéndice SI, Figura S10).En resumo, estes datos indican que a NMPylation de nsp9 mediada por NiRAN ten unha actividade conservadora nos coronavirus que representan diferentes xéneros da subfamilia dos ortocoronavirus.
NMPilación de nsp9 mediada por SARS-CoV-2 nsp12.(A) Xel de SDS-poliacrilamida tinguido de Coomassie que mostra a proteína recombinante utilizada na proba de NMPylation.Como control, utilizouse unha proteína mutante con substitución de sitio activo no dominio NiRAN (K4465A) e no dominio RdRp (DD5152/3AA) de SARS-CoV-2 nsp12.A numeración dos residuos baséase na posición en pp1ab.(B) Autorradiografía da detección de UMPylation usando nsp9-His6 e [α-32P]UTP como substrato de nsp12-His6 (tipo salvaxe [wt] e mutante).A masa molecular (en quilodaltons) da proteína marcada móstrase á esquerda.
Os dominios NiRAN consérvanse xeralmente en Nidovirales (16), o que indica que catalizan reaccións enzimáticas esenciais para a replicación do Nidovirus.Neste estudo, puidemos demostrar que o dominio NiRAN do coronavirus transfire NMP (xerado a partir de NTP) a nsp9, unha misteriosa proteína de unión ao ARN implicada na replicación do virus (26 ?? 29 ), para determinala como un obxectivo natural e socio de coronavirus RTC.
O dominio NiRAN comparte tres motivos de secuencia (AN, BN e CN), que conteñen un número moi pequeno de residuos que se conservan en todas as familias da orde Nidovirales monofilética pero moi diferenciada (8, 16).Estudos recentes demostraron que están estruturalmente relacionados cunha familia de proteínas tipo proteína quinase, en gran parte non caracterizada, que orixinalmente se chamaba familia SelO (17, 19, 22, 30, 31).As proteínas relacionadas con SelO teñen pregamentos quinase, pero carecen de varios residuos de sitios activos conservados nas quinases clásicas (22, 32).Baseándose na orientación inversa das moléculas de ATP unidas ao sitio activo e estabilizadas por interaccións específicas, se hipotetizouse e posteriormente confirmouse que SelO transfería AMP (en lugar de fosfato) ao substrato proteico (22), mentres que outra proteína bacteriana similar a SelO, YdiU, ten recentemente demostrouse que cataliza a unión covalente de UMP aos residuos de Tyr e His de diferentes substratos proteicos (33).
Co fin de confirmar e ampliar a predición dos posibles residuos do sitio activo do dominio NiRAN do coronavirus, utilizamos métodos bioquímicos e de xenética inversa para realizar análises de mutacións no coronavirus nsp12 (Figura 3D e apéndice E e SI, Figura S3 e táboa) S1â. S4).Os datos mostran que a substitución de HCoV-229E K4135, R4178 e D4280 por Ala elimina a actividade da NMP transferase in vitro e a replicación do virus en cultivos celulares (Figura 3D e apéndices E e SI, Figura S3), apoiando a súa presenza no γ-fosfato NTP. (K4135, R4178) e a coordinación dos ións metálicos do sitio activo (D4280).A substitución por E4145A do Glu conservado no rango do virus do niño de ave que se prevía para estabilizar a posición de K4135 (17) demostrou eliminar a replicación viral, pero sorprendentemente, a actividade mantívose no ensaio de NMPylation in vitro (Figura 3D e E e apéndice SI, figura S3 e táboas S1–S4).Unha observación similar fíxose cando se introduciu a substitución correspondente no homólogo YdiU de Salmonella typhimurium (E130A) (33).En conxunto, estes datos apoian a función reguladora deste residuo conservado máis que a función catalítica.
A substitución do residuo Phe conservado (F4281A) dentro do rango de nestovirus no dominio NiRAN HCoV-229E (8) deu lugar a unha diminución da actividade de NMPilación in vitro e unha diminución significativa da replicación do virus en cultivo celular (Figura 3D, E e SI) anexo, Figura S3).Os datos son consistentes coa importante función reguladora deste residuo, como o residuo Phe do motivo DFG homólogo mostrado anteriormente.Nas proteínas quinases clásicas, forma parte do bucle de unión de Mg2+ e axuda a montar e regular a columna vertebral???Necesario para unha actividade catalítica eficaz (32, 34).A substitución de Ala e Arg polos residuos K4116 (no motivo preAN), respectivamente, eliminou a replicación viral e, como era de esperar, tivo diferentes efectos sobre a actividade da NMP transferase in vitro, dependendo da cadea lateral de aminoácidos introducida (Figura 3D e apéndices E e SI). , Figura S3).Os datos funcionais son consistentes coa información estrutural, o que indica que este residuo estableceu unha interacción co fosfato ATP (17).No dominio NiRAN doutras familias de virus aniñados, a posición de HCoV-229E pp1a/pp1ab K4116 está ocupada por Lys, Arg ou His (8), o que indica que a restrición funcional deste residuo específico foi relaxada.A substitución de D4188A e D4283A elimina ou reduce fortemente a actividade enzimática e elimina a replicación do virus (Figura 3).Estes dous residuos consérvanse na maioría (pero non en todos) dos virus aniñados (8), o que indica unha importante función específica da familia pero posiblemente non catalítica.Como controis utilizáronse substitucións de Ala de varios outros residuos de Lys e Asp (K4113A, D4180A, D4197A e D4273A) que non se conservan nas familias Coronaviridae ou outras Nestioviridae (8).Como era de esperar, estas substitucións son en gran medida tolerables, cunha lixeira diminución da actividade enzimática e da replicación viral nalgúns casos (Figura 3 e apéndice SI, Figura S3).En xeral, os datos de mutaxénese do coronavirus son moi consistentes cos datos de auto-GMP e xenética inversa de EAV NiRAN-RdRp (16), nos que EAV nsp9 (coronavirus nsp12 ortholog) residu K94 (correspondente a HCoV-229E K4135) funcións importantes), R124 (correspondente a R4178), D132 (correspondente a D4188), D165 (correspondente a D4280), F166 (correspondente a F4281).Ademais, os datos de mutaxénese do HCoV-229E son consistentes e expandidos dos datos de xenética inversa do SARS-CoV (16), igualmente similares aos observados para o correspondente mutante Phe-to-Ala do motivo CN SARS-CoV_nsp12. fenotipo descrito -F219A e HCoV-229E_F4281A (Figura 3 D e apéndice E e SI, Figura S3 e Táboa S1-S4).
En comparación cos ortólogos EAV (16), que teñen unha clara preferencia por UTP e GTP (na reacción de auto-NMPilación), o noso estudo mostra que o dominio NiRAN do coronavirus (representado por HCoV-229E e SARS-CoV-2) pode ser eficaz. transferidos Os catro NMP, aínda que hai unha lixeira preferencia por UMP (Figuras 1 e 3).A especificidade relativamente baixa do co-substrato específico de NTP é consistente coa estrutura supercomposta SARS-CoV-2 nsp7/8/12/13 informada recentemente, na que ADP-Mg2+ se une ao sitio activo de NiRAN, pero non coa parte de adenina. da formación de interaccións específicas (17).No noso estudo, o tipo de nucleótido utilizado na reacción de NMPilación non ten ningún efecto diferencial sobre a actividade da proteína mutante (Anexo SI, Figura S3), o que indica que ningún destes residuos está estreitamente relacionado coa unión dunha nucleobase específica.Queda por estudar a base estrutural e o potencial significado biolóxico das diferentes preferencias de cosubstrato NTP observadas nos dominios NiRAN de coronavirus e virus arteriais;poden ser certas ou poden deberse ás limitacións dos seus respectivos estudos.Na actualidade, non se pode descartar que a actividade potencial NMPylator do dominio NiRAN do virus arterial (en comparación coa actividade de autoNMPilación previamente caracterizada) teña unha preferencia de co-substrato diferente, tendo en conta que a semellanza entre o arterial e o coronavirus. O dominio NiRAN está ao seu límite.Comparación baseada en secuencias (16).En comparación coa pseudoquinase SelO, que usa Mg2+ como cofactor, a actividade do coronavirus e do virus arterial NiRAN depende de Mn2+ (16) (Figura 3C e apéndice SI, Figura S1).A dependencia de Mn2+ e a preferencia obvia pola UTP é unha característica inusual dos NMPylators de proteínas, e só se confirmou recentemente na proteína YdiU de Salmonella typhimurium, que cataliza a estrita UMPilación da chaperona dependente de Mn2+ para protexer as células da indución do estrés. 33).
A semellanza estrutural descrita recentemente entre o dominio NiRAN do coronavirus e as proteínas quinases celulares (17, 19) proporciona un apoio adicional á capacidade de NiRAN para ligar covalentemente a NMP con outras proteínas que informamos neste estudo.Centramos a nosa busca de posibles obxectivos de NiRAN nas proteínas codificadas por HCoV-229E ORF1a, que se sabe que axudan directa ou indirectamente á replicase codificada por ORF1b de RTC (12, 35).Os nosos experimentos proporcionan probas concluíntes da NMPylation efectiva e específica de nsp9 (Figura 2).Se a proteína diana se usa nun exceso molar que é de 8 a 10 veces maior que o do encima (nsp12), confírmase que a nsp9 está completamente (mono)NMPizada (Figura 4).Concluímos que a interacción entre nsp12 e nsp9 é de curta duración e non formará un complexo estable con nsp9 (en ausencia doutras subunidades RTC).Esta conclusión está apoiada por estudos de interacción de proteínas sobre o proteoma SARS-CoV (35).A análise de MS identificou a amina primaria do residuo N-terminal de nsp9 como o sitio de NMPilación (apéndice SI, Figura S5).A formación do enlace fosforamidato e do grupo amino N-terminal distingue a actividade de NMPilación mediada por NiRAN da reacción de AMPilación mediada por SelO de Pseudomonas syringae, que cataliza a formación de AMP ligado a O nos residuos de Ser, Thr ou Tyr. 22), e S. typhimurium YdiU forma adutos peptídico-UMP ligados a O (con Tyr) e ligados a N (con His).A limitada información dispoñible sobre a familia de proteínas SelO indica que os membros desta gran familia de proteínas difiren moito na formación de aductos de péptido-NMP.Esta é unha observación interesante que merece máis estudo.
Os datos obtidos neste estudo levaron a hipótese de que a NMPilación de nsp9 require un N-terminal libre.No contexto da replicación viral, esta será proporcionada pola escisión proteolítica do sitio de procesamento nsp8|nsp9 na poliproteína replicase pp1a mediada por Mpro e pp1ab.Na maioría dos coronavirus, a diferenza entre este sitio específico (VKLQ|NNEI en HCoV-229E) e todos os outros sitios de escisión do coronavirus Mpro é que Asn (en lugar de outro pequeno residuo, como Ala, Ser ou Gly) ocupa P1â???Localización (36).Os datos de escisión de péptidos obtidos nos primeiros estudos mostraron que a eficiencia de escisión do sitio nsp8|nsp9 era menor que a doutros sitios, o que indica que 1) este sitio específico pode ter un papel regulador no procesamento coordinado oportuno do C-terminal. rexión pp1a, ou 2) a O papel do extremo N-terminal nsp9 conservado especial na replicación do virus (37).Os nosos datos (Figura 5A) mostraron que a forma recombinante de nsp9 que levaba a secuencia N-terminal real foi NMPized efectivamente por nsp12.A secuencia de flanqueamento N-terminal foi eliminada polo factor Xa (nsp9-His6; apéndice SI, táboa S1) ou por escisión mediada por Mpro (nsp7-11-His6; figura 5A e apéndice SI, táboa S1).É importante destacar que o precursor non cortado que contén nsp9 nsp7-11-His6 mostrou resistencia á NMPilación de nsp12, o que é consistente cos nosos datos, o que indica que o aduto nsp9-NMP fórmase a través da amina primaria N-terminal (apéndice SI, Figura S5) .Para obter unha comprensión máis profunda da especificidade do substrato de NiRAN, entón centrámonos nos residuos N-terminais adxacentes de nsp9.En ausencia doutras proteínas, son estruturalmente flexibles, o que impide que se detecten na forma non marcada de nsp9 (26 28, 38), o que indica a súa limitada variación natural. Isto débese á importante secuencia específica (non relacionada coa estrutura secundaria) función do fragmento N-terminal nsp9.As substitucións Ala de residuos conservados nesta rexión (Figuras 5C e D e apéndice SI, Figura S8) revelan que N3826 é esencial para a NMPilación de nsp9 in vitro, mentres que as substitucións de N3825A e E3827A conducen a unha diminución da NMPilación, mentres que as substitucións de M3829A e P3830A non o fan. .Obviamente afecta a nsp9 NMPylation.Aínda que a substitución de Asn N-terminal (N3825A, N3825S) ten só un efecto moderado sobre a NMPilación de nsp9 e a replicación do virus no cultivo celular (Figura 5C e D), a eliminación dunha secuencia de residuos de Asn do dipéptido 3825-NN do N-terminal. demostrou ser É letal para os virus, o que indica que é necesario un residuo de Asn antes que outro residuo no extremo N-terminal, preferentemente Asn, aínda que parece que a substitución de residuos semellantes pode tolerarse parcialmente (Figura 5B, C e D).Concluímos que o dipéptido 3825-NN, especialmente o residuo N3826 conservado e esencial dentro do intervalo do coronavirus (apéndice SI, Figura S6), garante a unión e a orientación correctas do extremo N-terminal nsp9 no sitio activo de NiRAN.
A substitución de Ala (E3827A) polo Glu conservado de todas as subfamilias mantén a NMPilación de nsp9 in vitro pero é letal para os virus en cultivo celular (Figura 5C e D), indicando a función adicional deste residuo, por exemplo, nas interaccións clave (NMPilado ou non modificado). ) nsp9 N-terminal e outros factores implicados na replicación do virus.As mutacións de Nsp9 non afectaron o proceso proteolítico de nsp9 ou de calquera nsp adxacente (39) (Apéndice SI, Figura S9), o que indica que os fenotipos letais de varias mutacións de nsp9 observadas non foron causados pola desregulación da área pp1a terminal do proceso proteolítico C. .
Os datos anteriores proporcionan evidencia de que despois do tratamento mediado por Mpro do sitio de escisión nsp8|9 en pp1a/pp1ab, o extremo N-terminal de nsp9 pode ser UMPilado (ou modificado parcialmente con outro NMP).Ademais, a excelente conservación do extremo N-terminal de nsp9 (incluíndo os residuos de Asn singulares e invariantes na familia do coronavirus) e os datos de xenética inversa obtidos neste estudo (Figuras 3E e 5D) levounos a concluír que a NMPilación de nsp9 descrita. está bioloxicamente relacionado e esencial para a replicación do coronavirus.Quedan por estudar as consecuencias funcionais desta modificación, por exemplo, no que se refire á actividade de unión ao ARN de nsp9 (forma non modificada) descrita anteriormente (2628).A NMPilación N-terminal tamén pode afectar a interacción de nsp9 con substratos de proteínas ou ARN ou a formación de diferentes conxuntos de catro niveis.Estes observáronse en estudos estruturais e confirmáronse que están funcionalmente relacionados coa replicación do coronavirus, aínda que especialmente en ausencia de No caso desta modificación (26- â29, 40).
Aínda que a especificidade obxectivo do dominio NiRAN do coronavirus aínda debe caracterizarse con máis detalle, os nosos datos mostran que a especificidade da diana da proteína do dominio NiRAN do coronavirus é moi estreita.Aínda que a conservación dos residuos de sitios activos clave (8, 16) no dominio NiRAN de todas as familias de nidovirus apoia fortemente a actividade do NMPylator conservado destas proteínas, a identidade dos residuos de bolsa de unión ao substrato deste dominio segue por ser caracterizada. , e poden diferir entre as distintas familias de fins Nidovirales.Do mesmo xeito, aínda non se determinaron os obxectivos relevantes doutros virus aniñados.Poden ser ortólogos remotos de nsp9 ou doutras proteínas, porque as secuencias fóra dos cinco dominios de replicase que xeralmente se conservan en virus aniñados están menos conservadas (8), incluíndo a matriz de xenomas entre Mpro e NiRAN. Entre elas, a nsp9 está situada no corona virus.
Ademais, actualmente non podemos descartar a posibilidade de que o dominio NiRAN teña obxectivos adicionais (incluídos os móbiles).Neste caso, cómpre mencionar que os homólogos bacterianos desta proteína emerxente NMPylators (NMPylators) (30, 31) parecen ter "reguladores mestres"?A NMP modula unha variedade de proteínas celulares para regular ou eliminar as súas actividades augas abaixo, xogando así un papel nunha variedade de procesos biolóxicos, como a resposta ao estrés celular e a homeostase redox (22, 33).
Neste estudo (Figuras 2 e 4 e Apéndice SI, Figuras S3 e S5), puidemos demostrar que nsp12 transferiu a parte UMP (NMP) a unha única posición (conservada) en nsp9, mentres que outras proteínas non foron modificadas no usado Nas condicións, admítese unha especificidade de substrato ben definida (en lugar de solta).En consonancia con isto, en comparación coa NMPilación de nsp9 N-terminal, a propia actividade de NMPilación de nsp12 é moi baixa, a súa detección require un tempo de exposición a autorradiografía máis longo e úsase un aumento de 10 veces na concentración de nsp12.Ademais, a nosa análise de MS non conseguiu proporcionar probas da NMPilación de nsp12, o que suxire que a autoNMPilación do dominio NiRAN é (no mellor dos casos) unha actividade secundaria.Non obstante, hai que ter en conta que outros estudos proporcionaron probas preliminares de que o estado de auto-AMPilación do NMPylator bacteriano pode controlar a súa actividade de NMPylator noutros substratos proteicos (22, 33).Polo tanto, necesítanse máis investigacións para investigar os posibles efectos funcionais das actividades de auto-NMPilación informadas para EAV nsp9 (16) e coronavirus nsp12 (este estudo), incluíndo o efecto de acompañamento proposto sobre o pregamento do dominio RdRp C-terminal. 16)).
Previamente, consideráronse varias hipóteses sobre as posibles funcións abaixo do dominio NiRAN nidoviral, incluíndo a ARN ligase, a guanilato transferase con ARN-capped e a actividade de cebado de proteínas (16), pero ningunha delas é compatible coas funcións posteriores dispoñibles.A información obtida nas seguintes posicións é exactamente o mesmo tempo sen facer supostos adicionais.Os datos obtidos neste estudo son máis consistentes con (pero non poden probar) que o dominio NiRAN está implicado no inicio da síntese de ARN inducida por proteínas.Antes críase que a función do dominio NiRAN en 5??Estes datos e o apoio doutros datos non afectan as reaccións de captación de ARN ² ou de ligadura de ARN.Polo tanto, por exemplo, considérase que o sitio activo de NiRAN implica o Asp conservado como base xeral (D252 en Pseudomonas syringae SelO; D4271 en HCoV-229E pp1ab; D208 en SARS-CoV-2 nsp12) (Apéndice SI, figura 2). ).S2) (17, 22, 33), mentres que a catálise na ARN ligase dependente de ATP e na enzima que capta o ARN realízase polo enzima covalente-(lisil-N)-NMP intermedio, que implica un residuo Lys non modificado ( 41).Ademais, a notable especificidade baseada en secuencias do coronavirus NiRAN para as dianas proteicas conservadas e a especificidade relaxada para os co-substratos de NTP (prefire UTP) oponse ás funcións similares á enzima de captación mediada por NiRAN ou á ARN ligase.
Obviamente, é necesario moito traballo extra para verificar e, se se proba, elaborar sobre o posible papel de nsp9-UMP (nsp9-NMP) na síntese de ARN inducida por proteínas, o que conectará varios informes interesantes pero (ata o momento) informados anteriormente. .Observacións illadas.Por exemplo, determinouse que o final do ARN da cadea negativa do coronavirus comeza cunha cadea oligo(U) (42, 43).Esta observación é consistente coa idea de que a síntese de ARN de cadea negativa iníciase unindo a forma UMPilada de nsp9 á cola poli(A) (disparadores), que pode ser promovida pola súa unión ao ARN. A actividade e/ou a interacción con outra proteína RTC.A porción UMP proporcionada por nsp9 pódese usar entón como "cebador" para a oligouridilación mediada por nsp7/8/nsp12, usando a cola 3??²-poli(A) no ARN xenómico ou outra secuencia que contén oligo (A) serve como modelo, similar ao mecanismo establecido para a proteína VPg do picornavirus (44).E se a proposta é "non normativa"????O inicio da síntese de ARN de cadea negativa (inducida por proteínas) proporciona unha ligazón ás observacións, o que indica que o ARN de cadea negativa do coronavirus ten UMP (en lugar de UTP) no seu extremo (42), o que se considera que indica que ácido nucleico Dicer corta o extremo fosforilado por unha endonuclease específica de uridina descoñecida.Se se confirma, esta actividade hidrolítica do ácido nucleico pode axudar a liberar a forma oligomérica UMPilada de nsp9 do extremo 5 ² da cadea negativa nacente.O posible papel da nsp9 no cebado de proteínas tamén é consistente con estudos de xenética inversa anteriores, que demostraron que nsp9 (e nsp8) interactúan de forma crítica e específica co elemento de ARN conservado que actúa preto do extremo 3 do xenoma do coronavirus.45).Segundo este informe, estas observacións anteriores agora poden ser reexaminadas e ampliadas mediante investigacións posteriores.
En resumo, os nosos datos determinaron a actividade específica dunha etiqueta enzimática de virus aniñada propietaria ligada a RdRp no extremo N-terminal.No coronavirus, esta actividade UMPylator/NMPylator mediada por NiRAN recentemente descuberta úsase para depender de Mn2+ e residuos de Asn adxacentes e provocar a formación de enlaces fosforamidato (de baixa enerxía) coa amina primaria N-terminal.Mediante a clivaxe mediada por Mpro no sitio de clivaxe nsp8|9, a diana nsp9 pódese usar para a NMPilación, o que indica o acoplamento funcional entre a protease e o dominio NiRAN, que se estende a RdRp.A conservación dos residuos clave no sitio activo de nsp12 NiRAN e o obxectivo nsp9, combinada cos datos obtidos de dous coronavirus, incluído o SARS-CoV-2, proporcionan probas sólidas de que a NMPylation de nsp9 é un coronavirus. As características conservadoras tamén son un paso clave na replicación do virus.Os datos dispoñibles lévannos a concluír que o papel específico da forma NMPilada de nsp9 na síntese de ARN inducida por proteínas é un escenario razoable para o coronavirus e outros virus aniñados, e que NiRAN tamén pode dirixirse a outras proteínas non identificadas.Regular o virus.Interacción do host.Se se confirma, a implicación de cebadores proteicos na síntese de ARN viral aumentará a afinidade de secuencia dos dominios Mpro/3CLpro e RdRp entre o coronavirus detectado previamente e o supergrupo tipo picornavirus (9), que agora se unificaron nas Pisoniviritas recentemente establecidas (9). 46) na categoría.
Os nosos datos tamén mostran que as actividades enzimáticas básicas, selectivas e conservadoras identificadas neste estudo poden usarse como dianas para medicamentos antivirais.Os compostos que interfiren coa unión (e a modificación posterior) do extremo N-terminal nsp9 conservado no sitio activo de NiRAN poden converterse en fármacos antivirais eficaces e versátiles, axeitados para o tratamento de coronavirus animais e humanos de diferentes (sub)xéneros Infeccións. , incluído o SARS-CoV-2 e o coronavirus da síndrome respiratoria de Oriente Medio.
A secuencia codificante da proteína coronavirus producida neste estudo foi amplificada por RT-PCR usando ARN illado de Huh-7 infectado con HCoV-229E ou Vero E6 infectado con SARS-CoV-2, e inserido mediante procedementos de clonación estándar.Vector de expresión pMAL-c2 (New England Biological Laboratory) ou pASK3-Ub-CHis6 (47) (apéndice SI, táboas S1 e S2).As substitucións de codóns únicos foron introducidas por mutaxénese dirixida a sitios baseada en PCR (48).Para producir a proteína de fusión MBP, as células TB1 de E. coli transformáronse coa construción plásmida pMAL-c2 adecuada (apéndice SI, táboa S1).A proteína de fusión purificouse mediante cromatografía de afinidade con amilosa e escindiuse co factor Xa.Posteriormente, a proteína C-terminal marcada con His6 purificouse mediante cromatografía de afinidade de metal inmobilizado con Ni (Ni-IMAC) como se describiu anteriormente (49).Para producir a proteína de fusión de ubiquitina, as células TB1 de E. coli utilizaron a construción plásmida pASK3-Ub-CHis6 adecuada (apéndice SI, táboas S1 e S2) e ADN plásmido pCGI que codifica a hidrolase C-terminal 1 específica da ubiquitina (Ubp1).Transformación (47).A proteína do coronavirus marcada con His6 C-terminal purificouse como se describiu anteriormente (50).
A proba de auto-NMPilación do HCoV-229E nsp12-His6 realizouse como se describe en EAV nsp9 (16).En resumo, nsp12-His6 (0,5 µM) contén ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinaetanosulfónico (HEPES)-KOH 50 mM, pH 8,0, ditiotreitol 5 mM (DTT), MnCl2 6 mM, tampón 25 µM, incubar o NTP especificado e 0,17 µM coincidiron con [α32-P]NTP (3.000 Ci/mmol; Hartmann Analytic) a 30 °C durante 30 minutos.En todos os demais ensaios de NMPilación (estándar) de NMPilación de nsp9 mediada por nsp12, as condicións de reacción axústanse do seguinte xeito: nsp12-His6 (0,05 µM) e nsp9-His6 (4 µM) en presenza de HEPES-KOH 50 mM (pH 80). ), DTT 5 mM, MnCl2 1 mM, NTP indicado 25 µM e [α32-P]NTP coincidente 0,17 µM.Despois de incubar durante 10 minutos a 30 °C, a mostra de reacción mesturouse con tampón de mostra SDS-PAGE: 62,5 mM de tris(hidroximetil)aminometano HCl (pH 6,8), 100 mM de DTT, 2,5% de SDS, 10% de glicerol e 0,005% de bromofenol. azul.A proteína desnaturalizouse quentando a 90 °C durante 5 minutos e separouse por SDS-PAGE ao 12%.O xel fíxase e téñense con solución Coomassie Brilliant Blue (40% metanol, 10% ácido acético, 0,05% Coomassie Brilliant Blue R-250), descolorízase e exponse a unha pantalla de imaxe fosforescente durante 20 horas (para detectar nsp12 da NMPilación) ou (máximo) 2 horas (para avaliar a NMPilación de nsp9).Utilizouse unha imaxe Typhoon 9200 (GE Healthcare) para escanear a pantalla e ImageJ para analizar a intensidade do sinal.
Para a análise de MS, utilizáronse 1 µM de nsp12-His6 e 10 µM de nsp9 (sen etiqueta de hexahistidina) na análise de NMPilación (apéndice SI, táboa S1) e utilizouse a concentración aumentada de 500 µM de UTP e GTP.Dependendo da súa concentración e da calidade esperada das proteínas, utilizouse un sistema de HPLC Waters ACQUITY H-Class equipado cunha columna MassPrep (Waters) para desalar de 1 a 10 µL de solucións proteicas tamponadas en liña.A proteína desalada elúese na fonte iónica de electrospray do espectrómetro de masas Synapt G2Si (Waters) a través do seguinte gradiente de tampón A (auga/0,05% de ácido fórmico) e tampón B (acetonitrilo/0,045% de ácido fórmico), e a temperatura da columna é 60 ° C e un caudal de 0,1 mL/min: elución isocrática con 5% A durante 2 minutos, despois un gradiente lineal ata 95% B en 8 minutos, e manter o 95% B durante outros 4 minutos.
Detéctanse ións positivos cun rango de masas de 500 a 5000 m/z.O glu-fibrinopéptido B mídese cada 45 segundos para a corrección automática da deriva de masa.Use o software de instrumentos MassLynx coa extensión MaxEnt1 para desconvolver o espectro medio despois de deducir a liña de base e suavizar.
O HCoV-229E nsp9 UMPilado foi dixerido engadindo tripsina modificada de grao de secuenciación (Serva) e incubouse durante a noite a 37 °C.Utilizouse unha columna de spin Chromabond C18WP (número de peza 730522; Macherey-Nagel) para desalar e concentrar os péptidos.Finalmente, o péptido disolveuse en 25 µL de auga, que contiña un 5% de acetonitrilo e un 0,1% de ácido fórmico.
As mostras foron analizadas por MS utilizando un espectrómetro de masas Orbitrap Velos Pro (Thermo Scientific).O sistema nanoâ HPLC definitivo (Dionex), equipado cun 50 cm montado no extremo personalizado.Columna C18 RP de 75 μm embalada con perlas magnéticas de 2,4 μm (Dr. Albin Maisch High Performance LC GmbH) Conéctese ao espectrómetro de masas en liña a través da fonte de nanospray Proxeon;inxectar 6 µL de solución de dixestión de tripsina nun diámetro interior de 300 µm ×??Columna de preconcentración C18 PepMap de 1 cm (Thermo Scientific).Usando auga/ácido fórmico ao 0,05% como disolvente, a mostra foi atrapada e desalinizada automaticamente a un caudal de 6 µl/min.
Os seguintes gradientes de auga/0,05% de ácido fórmico (disolvente A) e 80% de acetonitrilo/0,045% de ácido fórmico (disolvente B) utilizáronse para conseguir a separación de péptidos trípticos a un caudal de 300 nL/min: 4% B para 5 minutos, despois un gradiente lineal de 30 A ata o 45% de B en minutos e un aumento lineal ata o 95% de disolvente B dentro de 5 minutos.Conecte a columna cromatográfica a un nanoemisor de aceiro inoxidable (Proxeon) e pulverice o eluyente directamente no capilar quentado do espectrómetro de masas utilizando un potencial de 2.300 V. A exploración da enquisa cunha resolución de 60.000 no analizador de masas Orbitrap está asociada. con polo menos tres exploracións de MS/MS de datos, excluídas dinámicamente durante 30 segundos, utilizando disociación inducida por colisión de trampa iónica lineal ou disociación de colisión de maior enerxía combinada coa detección de orbitrap. A resolución é de 7.500.
Hora de publicación: 03-ago-2021